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カスタムsiRNA/一本鎖RNA合成サービスについて
MISSION® siRNAについて
siRNA実験全般について
カスタムsiRNAサービスについて
Q1. GMPグレードのsiRNAの取り扱いはありますか?
A1. 残念ながら、現時点では行っておりませんが、in vivoグレードのsiRNAをご用意しておりますので、ご検討ください。
Q2. siRNAのアニーリングはどのように行っていますか？
A2. Tuschl のプロトコルを使用しています。 アニーリングを行う際は、相補する一本鎖のRNAをアニーリングバッファー(100 mM potassium acetate, 30 mM HEPES-KOH at pH 7.4, 2 mM magnesium acetate)で溶解して混合し、90℃で1分間加熱します。その後、37℃で1時間インキュベートして、アニーリングを行っています。
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Q3. siRNAの精製グレードはどれが良いのでしょう？
A3. 一般的にsiRNA duplexは脱塩(DST)グレードで、問題なくお使いいただけます。
精製を行うことで、完全長産物の割合を増やすことができます。弊社のsiRNAs それぞれ脱塩を行った一本鎖RNAをアニーリングして二本鎖にしていますので、合成反応時の副産物などが除去されています。Duplex形成は、非変性PAGEゲルにて全数チェックされていますので、安心してお使いいただけます。
Q4. siRNAとはなんですか？
A4. RNA interference (RNAi)は転写後遺伝子サイレンシングとして知られており、低分子干渉RNA(siRNA) duplexが対象となるmRNAの破壊を誘導する、自然の生物学的遺伝子抑制メカニズムです。これらのsiRNA duplexは、長い二本鎖RNAを分解する酵素、Dicerによって自然に産生されます。また、 合成siRNAを細胞に導入することにより、RNAiパスウェイの後半部分を誘導することができます。これらsiRNAと呼ばれる21-23塩基のフラグメントは、RNaseを含む複合体であるRNA-induced silencing complex(RISC)に取り込まれます。ATPに依存するsiRNA duplex の巻き戻しは、RISCの活性化に必要です。この複合体は、siRNA duplexを巻き戻し、センス鎖を放出します。RISCに結合したアンチセンス鎖は、相補するmRNA配列のターゲティングに必要なガイドとして働き、結果として、mRNAの切断と分解を引き起こします。
*Hammond, S.M., et al., Post-transcriptional gene silencing by double-stranded RNA. Nat Rev Genet., 2, 110-9 (2001).
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Q5. siRNAの平均的な分子量は？
A5. 実際の分子量は、製品添付のテクニカルデータシートに記載されています(g/mol)。21merの siRNA duplexの平均的な分子量は、～13,300 g/molです。
Q6. siRNAの安定性は？
ULイエローカードは何ですか
A6. 弊社R&Dグループの実験によると、乾燥品のsiRNA duplex は-20℃保存で3年間は安定であるとのデータが得られています。 乾燥品のsiRNA duplexは室温で二年間保存した後でも、微量の分解が見られた程度でした。これはあくまでも二本鎖のRNAについての知見です。
Q7. siRNA溶液は、何回凍結融解できますか？
A7. 凍結融解の繰り返し、あるいは「frost-free」の冷凍庫での保存はお勧めしません。siRNA溶液は、non-frost-free の冷凍庫で、-20℃で約半年間保存可能です。凍結乾燥品はより長く安定です。凍結融解は、3-5回以内にとどめてください。
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Q8. siRNA duplexのお勧めの保存方法は？
A8. siRNA(または一本鎖ＲＮＡ)は、4℃にて保存してください。1～2週間は安定です。
長期保存の場合は-20℃での保存をお勧めいたします。その際は、使い切る分量で小分けするなどして、凍結融解の繰り返しは避けてください。また、蛍光修飾品は、アルミホイル等で遮光した状態で保存してください。これらを満たした条件下では6ヶ月間は安定です。
Q9. siRNAの末端に修飾はできますか？また、修飾塩基を含んだsiRNAはできますか？
A9. はい。可能です。価格・納期につきましては、ご希望の配列・収量・修飾の種類・部位を添えて、弊社までお問い合わせください。
Q10.一本鎖RNAの各精製グレードの純度は何％くらいですか？
A10. 配列の合成難易度によって前後いたしますが、一般的な配列の20merの一本鎖RNAとして、脱塩グレードで、約60%、HPLC, PAGE精製グレードでは、約90-95%となります。
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MISSION® siRNAについて
Q1. MISSION® siRNAで使われているOverhangはなんですか？
A1. MISSION® siRNAでは、dTdTのOverhangを使用しています。（Elbashir et al. 2001*："The thymidine overhang was chosen because it may enhance nuclease resistance of siRNAs in the cell culture medium and within transfected cells."）初期のRNAi研究では、dTdTを選択するケースが多かったようです。siRNAはdTdT Overhangでデザインされているケースが多いですが、UUやUGオーバーバングもよく見受けられます。2001年以降のElbashir et al.の論文のいくつかでは、siRNAデザインのルールのアウトラインが示されています。しかし、UU Overhangと同様にdTdT Overhangが使われているようです。
* Elbashir, S.M., et al., Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in mammalian cell culture. Nature 411(6836), 494-8 (2001). (PMID 11373684)
Q2. Rosetta アルゴリズムとはどのようなものですか？
溶接のMIGは何の略ですか
A2. Rosetta siRNA デザインアルゴリズムは、Position-Specific Scoring Matrices (PSSM)および重要なsiRNA seed regionに対する知見を利用し、対象遺伝子に対する最も効果的で特異性の高いsiRNA配列を予測します。さらに、Rosetta siRNA デザインアルゴリズムは、3年間に渡る遺伝子サイレンシング実験のフィードバックを基に改良され、このアルゴリズムのin-silicoでのルールが、現実の実験に基づいた証拠によって、より確かなものとなっています。
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Q3. なぜ、Your Favorite Geneの検索結果で、異なる複数のRefSeq.No.シーケンスが表示されるのですか？
A3. YFGで複数のRefSeq No.が表示される場合は、その遺伝子が複数のtranscript variantを持つことをあらわしています。Rosettaアルゴリズムは、それぞれのtranscriptごとに予測を行っています。
Q4. どのMISSION siRNAを注文すればよいかわかりません。ランキングのナンバーは何を意味していますか？
A4. MISSION siRNAは、siRNAの応用研究のリーダーであるRosetta Inpharmaticsからライセンスを受けた、ワールドクラスのsiRNAデザインアルゴリズムを使用してデザインされています。MISSION siRNAのランキングは1が最も高いノックダウン効率を示すと予想されているsiRNAとなります。ポジティブコントロールや、ノックダウン確認済みのValidated MISSION siRNAは、YFGの "siRNA Type" 列でご確認いただけます。
Q5. MISSION siRNAは化学修飾されたsiRNAですか？また、配列は公開されていますか？
A5. いいえ。MISSION siRNAは未修飾のsiRNAです。製品のお届けの際に添付される、データシートに配列が記載されています。誠に恐れ入りますが、ご注文の前に配列を公開することはできませんので、ご了承ください。
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siRNA実験全般について
Q1. N-TERを用いたsiRNAのReverse Transfectionのプロトコルはありますか？
A1. はい。こちら(508KB PDF)のウェブサイトをご覧ください。
Q2. siRNAによる遺伝子のサイレンシングはどれくらい持続しますか？
A2. 一般的にsiRNAを用いた遺伝子のサイレンシングは、トランスフェクションの24時間後に評価されます。この効果は5-7日間持続すると言われています。しかし、持続期間やノックダウンレベルは、細胞種やsiRNAの濃度に大きく依存します。ノックダウンを維持するには、繰り返しトランスフェクションを行うと良いでしょう。
Q3. siRNAの効果を増強するためにはどうしたら良いでしょうか？
どれだけ高いポンプは水を引くことができます
A3. エノキサシンをsiRNA実験に用いることで、ターゲット遺伝子に対するsiRNAのノックダウン効果を増強させることができる、という報告*があります。
*Shan, G., et al., A small molecule enhances RNA interference and promotes microRNA processing. Nature Biotechnology 26: 933-40 (2008).
もう一つの論文も参考になるかと思います。
Duxburya, M.S., et al., RNA interference: A mammalian SID-1 homologue enhances siRNA uptake and gene silencing efficacy in human cells. Biochemical and Biophysical Research Communications 331(2): 459-463 (2005).
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Q4. nmolからµgに変換するには？
A4. 分子量とnmol数は、添付のQuality assurance documentに記載しております。
計算例として、 分子量: 13,300のsiRNA 10nmolをµgに換算してみましょう。
例： 10 nmol x 13,300 g/mol x 10-9 x 106 = 133µg となります。
Q5. 各種培養プレートに適したsiRNAの量は？6-wellプレートを使用する場合、2 OD(10 nmol)でトランスフェクションできるウェル数は？
A5. 下記の表をご参照ください。注：siRNA 最終濃度 30nMの場合。
| Typical siRNA experiment reagent amounts | ||||
|---|---|---|---|---|
| Format | Transfection Reagent (µL) | siRNA (pmol) | cells / well | Final Volume (mL) |
| 96 well | 0.3-1 | 3 | 6,000 | 0.1 |
| 24 well | 1-3 | 15 | 40,000 | 0.5 |
| 12 well | 2-4 | 30 | 80,000 | 1 |
| 6 well | 3-6 | 75 | 200,000 | 2.5 |
* 6-wellプレートで, 10 nmolのsiRNAを使用する場合、10,000 pmol / 75 pmol/well = 約 133 well 分 となります。
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Q6. 新しく実験を始めるのですが、siRNAの適切な濃度は？
A6. 新しく実験を始められる際には、それぞれの細胞種に最適なsiRNA濃度を確認するため、小規模の予備実験を行うことをお勧めします。この場合、siRNAは最終濃度 5-100nMに設定しますが、一般的には、30nMのsiRNA濃度ではじめられるのが良いでしょう。できるだけ低濃度でのノックダウンを行うのが理想です。低濃度で使用することで、オフターゲットリスクを軽減できます。
Q7. 非常に安定して発現している遺伝子をノックダウンさせたいと考えています。siRNAの実験で、効果はありますか？
A7. GAPDHやCyclophilin Bなどのhousekeeping geneのような安定的な遺伝子でも、典型的なsiRNAアプローチによって効果的にサイレンシングされています。
MISSION siRNAは、高発現で安定的な遺伝子も非常に効果的にノックダウンできます。その遺伝子のタンパク質が極めて安定であっても、mRNAの安定性はsiRNAを用いた実験の大きなファクターにはならない、ということです。RNAiのプロセスは、直接mRNAを切断し、結果として細胞のヌクレアーゼによる分解を引き起こします。正確な実験条件を決めるためには、ターゲット遺伝子に対するsiRNAの最適な濃度を探すことが重要です。
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Q8. 浮遊細胞にはどのようにトランスフェクションすればよいですか？
A8. 申し訳ありませんが、弊社では浮遊細胞に適したトランスフェクション試薬をご用意しておりません。
Q9. siRNAトランスフェクションのプロトコルや試薬はありますか？
A9. トランスフェクション試薬や細胞種によって大きく条件が異なるため、単一のプロトコルというものはご用意しておりません。トランスフェクション試薬については、弊社では、N-TER Nanoparticle Transfection System (SIGMA , N2913)をお勧めしております。N-TERは浮遊細胞にはお使いいただけません。しかし、細胞種がストレスを受けたり、分化した後に接着能を生じる場合があり、そのケースではN-TERが効果を示しました。これはU937 cellで確認されています。U937は通常の浮遊細胞の状態ではお使いいただけませんが、ストレスを受けると接着を開始し、N-TERを用いてのトランスフェクションが可能になります。
もし、他のトランスフェクション試薬をお使いの場合は、製品添付のプロトコールに従ってください。
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Q10. 手持ちの細胞種に対するトランスフェクション条件の最適化はどのように行えばよいですか？
A10. ある特定の細胞種に最適なトランスフェクション条件を決定するには、細胞密度とsiRNA濃度のマトリクスをご用意されることをお勧めいたします。最適化には、Validatedや非常に効果の高いsiRNAを使われるのが良いでしょう。細胞種によっては、培地の血清の有無をマトリクスに加える必要があるかもしれません。
細胞種に関わらずN-TER/siRNA 複合体は、細胞にすばやく浸透するため、長時間インキュベートする必要はありません。ほとんどの接着細胞は、不死化・プライマリー関わらず、N-TERによってトランスフェクション可能です。
Q11. ネガティブコントロールには何を使えばよいですか？
A11. MISSION® siRNA Univarsal Negative Controlをお勧めいたします。その他、スクランブルコントロールのデザインも承っておりますので、ご希望の際はお問い合わせください。
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